واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

براي سنتز و تكثير In vitro توالي هاي نوكلئوتيدي ويژه‌اي كه فقط تعداد خيلي كمي از آنها در يك نمونه حضور دارد. PCR به وسيله‌ي موليس در 1987، تعريف و نامگذاري شده است.

واكنش PCR شامل يک چرخه‌ سه مرحله‌اي است:

1. واسرشت شدن
2. اتصال پرايمر به DNA الگو (هيبريد شدن)
3. گسترش (پليمريزاسيون)

تعداد چرخه های PCR:

تعداد چرخه ها مطابق با طبيعت بافت و توالي هدف، اپتیمایز مي شود.n تعداد چرخه ها را نشان مي دهد.

n 2 = تعداد رونوشت ها

مواد و وسایل مورد نیاز در PCR:

1. داكسي نوكلئوتيد تري فسفات (dNTP)

به شكل مايع (در آب فوق خالص) با 7= pH  يا در شكل لیوفیلیزه

به شکل جداگانه (dTTP، dGTP،dCTP،dATP  ) يا به شکل مخلوط هم مولار

2. پرايمرها

پرايمرها، يك جفت اليگونوكلئوتيدهای سنتزی هستند كه توالی شان مكمل با هر یک از رشته های DNA است. پرايمرها شامل يك توالی 20 تا 22 مری هستند و  محتوی 50 تا 55 درصد CG.

يك پرايمر آنتی سنس (Revers)

يك پرايمر سنس (Forward)

دماي اتصال پرايمر   Ta=Tm -5

برای بدست آوردن دمای ذوب، برای پرایمرهايی تا 20 نوکلئوتید، از فرمول زیر(فرمولWallace ) استفاده می شود:

(C  +  G) ×4 + (A+T) ×2 = Tm

3. آنزیم

آنزيمی که اغلب استفاده مي شود، DNA Taq پليمراز است.DNA Taq پليمراز از يك باكتري گرمادوست به نام Thermus Aquaticus  مشتق شده است. این باکتری در مكان های گرم در دمای  C˚70 زندگی می کند.

در PCR، مهم ترين ویژگی هایی که یک آنزيم باید دارا باشد، عبارتند از:

1. خاصیت گسترش دهندگی:

عملکرد Taq DNA  پلیمراز به طور متوسط گسترشbp  500 در 15 تا 20 ثانيه است.

2.  دقت:

ميزان خطاي عمومي براي یکTaq DNA پليمراز در حدود 4-10 است (یعنی یک خطای نوکلئوتیدی به ازاي الحاق 10000 نوکلئوتید).

3. پایداری حرارتی:

در C˚ 95،  نيمه عمر بين 1 و 3 ساعت بسته به آنزيم متفاوت است.

سایر آنزیم ها:

DNA  EXTRAPOL  پليمراز، Pfu DNA پليمراز،  Tgo DNA پليمراز، Tth DNA پليمراز

4. بافر واکنش

از ترکیبات زیر تشکیل می شود: Tris-HCl، در غلظت هاي متفاوت و pH 8، mM500 KCl، EDTA، DTT

5. محلول MgCl2

6. آب استريل

7. 
   

   DNA الگو

8. ترموسایکلر

 انواع دستگاه ترموسایکلر:

تک بلاک

دو بلاک

بلاک متغیر

انواع پلیت ترموسایکلر:

پلیت کریستالی

پلیت رنگی

پلیت متغیر

پلیت های فیلتردار Filter Plates:

برای انواعی از کاربردها مانند: جداسازی پلاسمید، خالص سازی DNA، آزمایش های اتصال لیگاند به گیرنده استفاده می شود.

دما و مدت زمان يک چرخه PCR:

1. مرحله واسرشت شدن:

مرحله باز شدن دو رشته DNA ، که در این مرحله دمای دستگاه را معمولا تا دمای ۹۴ تا ۹7 درجه سانتیگراد بالا برده که این دما باعث گسستن پیوند های هیدروژنی دو رشته DNA  می شود. 30-60 ثانیه

2. مرحله اتصال پرایمر:

در این مرحله پرایمر به توالی مکمل خود در متصل می شوند. دمای دستگاه را معمولا 70 تا 55 درجه سانتیگراد قرار می دهند. 30-90 ثانیه

3. مرحله گسترش:

در این مرحله تکثیر توسط آنزیم انجام می شود. دمای دستگاه را معمول 72 درجه سانتیگراد سانتیگراد قرار می دهند. 30-90 ثانیه

دستور العمل PCR

آماده کردن محیط واکنش

محیط واکنش در میکروتیوب های ml 0.2 استریل که اختصاصاً برای PCR طراحی شده اند، آماده می شود. این مخلوط مواد زیر است:

بافر آنزیم پلیمراز

dNTPs

پرایمرپیشرو Forward

پرایمرپیرو Revers

آنزیم Taq DNA Polymerase

MgCl2

آب مخصوص PCR

DNA الگو