پی سی آر (PCR)

خدمات مولکولی

آزمایشات تخصصی PCR در آزما اکسیر پژوه

انواع آزمون های PCR که در آزما اکسیر پژوه ارائه می گردد:

۱- تشخیص انواع میکروارگانیسم ها از قبیل: لاکتوباسیلوس ها، کلستردیوم ها، باسیلوس ها و ….

۲- شناسایی تقلبات غذایی در فرآورده های گوشتی

۳- شناسایی تراریخته ها

۴- شناسایی منشاء ژلاتین

Polymerase Chain Reaction (PCR)

خدمات تخصصی PCR

از50 سال پيش كه ساختار 2 رشته ای DNA توسط واتسون وكريك كشف شد پيشرفتهای وسيعی در علوم زيستی بوجود آمده است. اين پيشرفت ها و اكتشافات باعث پيدايش شاخه های از علم همچون بيوتكنولوژی نوين و مهندسی ژنتيك شده است. در اين ميان PCR نقش بسزايی در تحول علوم زيستی داشته است كه باعث تغيير نگرش دانشمندان در تحقيقات پزشكی، علوم پايه، آزمايشات جنايی و تحقيقات زيست محيطی شده است. اين تکنِِيک در اواسط دهه ی 1980 بوسيله ی کری موليس معرفی شد .

امروزه اين روش تقريباً در تمامی آزمايشگاه های زيست مولکولی جزو کارهای متداول می باشد و به صورت اتوماتيک بوسيله ی کامپيوتر انجام می شود. اين تکنيک تمامی مشکلات قبلی در زيست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادير زياد از DNA يکسان بود را برطرف کرد .

برای مثال قبلاً برای بدست آوردن نسخه های متعدد از يک ژن خاص می بايست اين ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در يک باکتری تکثير کنند ولی امروزه اين کار را به سادگی و با استفاده از PCR انجام می دهند.

PCR از نظر اصول عملی تشابه زيادی به همانند سازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است.

ياد آوری می شود که DNA پليمراز DNA تک رشته ای را از جهت 3َ به 5َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار مي دهد ورشته مکمل را در جهت 5َ به 3َ مي سازد. PCR روشی حساس برای پی بردن به وجود DNA مورد نظر حتی در مقادير بسيار كم می باشد. PCR مزايای زيادی دارد.

كاربردهای PCR :

تکنيک PCR کاربردهای نا محدودی در عرصه های مختلف زيست مولکولی دارد ، علت اصلی اين امر اين است که DNA الگوی بکار رفته در PCR را می توان از منابع مختلف تامين کرده و مورد استفاده قرار داد .

بطور کلی PCR به دو منظور اصلی بکار می رود :

1 – تهيه ی نسخه های متعدد از يک ژن

2 – بررسی حضور يا عدم حضور يک ژن خاص در يک قطعه DNA

تهيه ی نسخه های متعدد از يک ژن:

براي اين کار بجای اينکه هر دو پرايمر مورد نياز برای PCR را به يک ميزان به محيط واکنش اضافه کنند ، يکي از پرايمر ها را به تعداد کمتر پرايمر ديگر را به تعداد بيشتر اضافه می کنند . در هنگام انجام PCR ، در ابتدا هر دو رشته با هم همانند سازی می کنند ولی پس از تمام شدن يکی از پرايمر ها فقط رشته ديگر که هنوز پرايمر آن وجود دارد ساخته می شود و به همين دليل نسخه های بيشتری از اين رشته بوجود می آيد. پس از پايان PCR چند نسخه DNA دو رشته ای از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد که می توان به طور مستقيم در روش سنگر بکار برد .

مثال ديگری از کاربردهای PCR بررسی پيوستگی ژنها و تعيين فاصله ی بين ژنها بر روی کروموزوم های انسان است . در ژنتيک برای تعيين فاصله ی بين ژنها از بررسی تعداد نوترکيب ها به نسبت فنوتيپ والدين استفاده می شود . اين روش برای مگس سرکه که زادآوری آن در هر نسل بسيار زياد و دوره ی رشد آن نيز کوتاه است به راحتي قابل انجام است ولی در مورد انسان که زاده های آن در هر نسل بسيار محدود و با فاصله ي زمانی زياد می باشد ، اين بررسی ها به سختی و با محدوديت بسيار انجام می گيرد .

ولی امروزه دانشمندان با استفاده از PCR روش جديدی را برای اين کار پيدا کرده اند . برای اين کار از بررسی آلل های موجود در يک اسپرم استفاده مي شود . از آنجائيکه اسپرم ها هاپلوئيد بوده و در هر اسپرم از هر کروموزوم يک عدد وجود دارد ، با بررسی همزمان دو ژن بر روی يک کروموزوم و تعيين ميزان نوترکيبی بين اين دو ژن می توان فاصله ی ژنتيکی بين دو ژن را تعيين کرد . در واقع از نظر ژنتيکی بررسي 1000 اسپرم با بررسی 1000 فرزند يک خانواده برابر است . با استفاده از اين روش ثابت شده است که ميزان نوترکيبی کروموزوم ها در مردها با ميزان نوترکيبی در زنها متفاوت است .

به جرات می توان گفت که اين کاربرد دوم PCR مهمترين کاربرد آن و علت اصلی گسترش روزافزون آن در کليه ی شاخه های علوم زيست مولکولی است.

تعدادی از کاربردهای پزشکی PCR

تشخيص قبل از تولد بيماريهای ژنتيکی

در اين روش تعدادی از سلول های جنين را استخراج کرده و با پرايمر اختصاصی برای يک ژن بيماری مجاور می کنند ، همچنين بطور جداگانه با پرايمر ژن سالم نيز مجاور می کنند و PCR انجام می دهند . پس از پايان PCR تفسير آزمايش چنين خواهد بود : اگر در هردو لوله سنتز DNA انجام شود ، جنين يک ژن سالم و يک ژن بيمار دارد يعنی حامل است ولی بيمار نيست . اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که شناساگر مخصوص ژن بيمار وجود دارد انجام شود جنين بيمار است و بايد سقط شود . اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که حاوی شناساگر ژن سالم است انجام شود ، جنين کاملاَ سالم است .

تعيين جنسيت جنين

برای اين کار تعدادی از تخمک های زن را خارج می کنند و در شرايط آزمايشگاهی با اسپرمها آميزش می دهند و هر يک از سلولهای تخم تشکيل شده را بطور جداگانه کشت می دهند تا اينکه جنين به مرحله ی 10 سلولی برسد . سپس از هر جنين يک سلول را جدا کرده و همراه با پرايمرهای اختصاصی برای کروموزوم y در لوله PCR وارد می کنند.سپس PCR و در پايان الکتروفورز انجام می شود. .

بررسی عفونت های باکتريایی و ويروسی

هم اکنون در بعضی از آزمايشگاه ها از PCR برای تشخيص ايدز استفاده می کنند. برای اين کار از خون محيطی نمونه گيری می کنند و از توالی های اختصاصی ويروس HIV نيز به عنوان شناساگر استفاده می کنند ، سنتز DNA نشان دهنده ی عفونت ايدز است. استفاده ديگر PCR در تشخيص بيماری سل می باشد . مايکوباکتريوم توبرکلوزيس يک باکتری بسيار کند رشد است و رشد معمولی آن در آزمايشگاه حدود 20 روز طول می کشد. در PCR بيماری سل از نمونه ی خلط فرد بيمار به همراه پرايمرهايی که برای توالی خاص مايکوباکتريوم های مکمل می باشند ، مورد استفاده قرار می گيرد .

تشخيص جهش ها و سرطان ها

در هر سلول معمولاَ از يک ژن فقط يک نسخه وجود دارد ، و در صورتی که اين ژن دچار جهش شود بررسی اين جهش بسيار مشکل خواهد بود ، زيرا در سلول های انسان پيدا کردن يک ژن در ميان کل ژنوم انسان ، همانند پيدا کردن سوزن در انبار کاه خواهد بود و پس از پيدا کردن ژن جهش يافته نيز به دليل محدوديت نسخه های اين ژن بررسی کميت و کيفيت جهش در آن مشکل خواد بود .

تعيين توالی های کروموزومی انسان در سلولهای هيبريدی

يکي از تکنيکهای بررسی ژنوم انسان ، تلفيق ( هيبريد کردن ) هسته های سلول های انسانی با سلول های حيوانات ديگر مثلاَ موش است . پس از انجام تلفيق دو هسته ، کروموزوم های انسان به تدريج حذف می شوند ، تا اينکه نهايتاَ يک کروموزوم در درون هسته هيبريدی باقی می ماند . حال گاهی به منظور بررسی های بيشتر لازم می شود که اين قسمت های ژنوم انسان تکثير شوند ، مثلاَ وقتی که يک ژن خاص مورد بررسي قرار مي گيرد . براي اين کار از نوع خاصی از PCR که به Alu-PCR معروف است استفاده می شود.